Môi trường Bacillus sp. – Trực khuẩn | Môi trường tăng sinh đậm đặc

Trong số rất nhiều loài vi sinh sử dụng trong nuôi trồng thủy sản thì Bacillus sp. (hay còn gọi là trực khuẩn) là một trong những loài vi sinh vật có rất nhiều tiềm năng. Bacillus subtilis là một loại vi khuẩn đặc biệt, có khả năng tạo ra nhiều tác dụng có lợi trên vật chủ như: cải thiện tăng trưởng, tỷ lệ sống, chất lượng nước, thành phần dinh dưỡng trong thức ăn lên men, hỗ trợ cung cấp vắc xin…

1. Giới thiệu về trực khuẩn Bacillus subtilis

1.1. Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis.

Nuôi cấy Bacillus subtilis (nguồn: Wiki)

Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis.

Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời. Bacillus subtilis được sử dụng ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy…

Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường…

1.2. Phân loại

Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:

• Giới (Kingdom): Bacteria
• Ngành (Division): Firmicutes
• Lớp (Class): Bacilli
• Bộ (Order): Bacillales
• Họ (Family): Bacillaceae
• Giống (Genus): Bacillus
• Loài (Species): Bacillus subtilis

2. Đặc tính sinh học

Bacillus subtilis dạng hình que, có khả năng tạo bào tử cũng như chịu đựng điều kiện môi trường khắc nghiệt.

Bacillus subtilis có thể phân chia đối xứng tạo thành hai tế bào con, hoặc không đối xứng, tạo thành bào tử trong điều kiện môi trường bất lợi như hạn hán, bức xạ cực cao, môi trường nghèo dinh dưỡng. Các tế bào vi khuẩn có thể tự tạo ra các chất kháng sinh hoặc giết chết đồng loại để tìm dinh dưỡng trong điều kiện môi trường sống khắc nghiệt, trước giai đoạn hình thành bào tử.

Ảnh minh họa Bacillus sp. (nguồn: nativeformulas.com)

Bởi tính ổn định cao của Bacillus subtilis trong điều kiện khắc nghiệt nên vi sinh vật này trở thành một trong những ứng cử viên hoàn hảo với các ứng dụng chế phẩm sinh học hoặc trong đồ uống, thực phẩm, khử trùng, xử lý môi trường ô nhiễm, … Cụ thể:

Bacillus subtilis thường có trong sản phẩm ở trạng thái bào tử, do vậy, khi uống vào, nó không bị acid và các men tiêu hóa ở dịch vị dạ dày phá hủy. Ở ruột, bào tử phát triển thành thể hoạt động, giúp cân bằng hệ vi sinh có lợi trong đường ruột, cải thiện hệ thống tiêu hóa sau khi sử dụng kháng sinh thời gian dài.

2.1. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 106 – 107 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm.

Xem thêm 5 điểm khác nhau giữa vi sinh hiếu khí và vi sinh kỵ khí

Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì (trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương, chao… Bacillus subtilis đóng vai trò đáng kể về mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học.

Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB).

Nguồn dinh dưỡng cơ bản của Bacillus subtilis (nguồn: dinhduongsaigon.com)

Năm 1993, giáo sư Richard Losik và cộng sự thuộc Đại học Havard ở Boston (Mỹ) và Jose Gonzalez-Pastor của Trung tâm công nghệ sinh học quốc gia ở Madrid (Tây Ban Nha) đã chứng minh được loài Bacillus subtilis có tập tính ăn thịt đồng loại. Chúng dùng cách này như một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp có đời sống giới hạn như dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt.

Một cách đơn giản là các cá thể khỏe mạnh sinh tổng hợp kháng sinh tiêu diệt những cá thể xung quanh cả khác loài lẫn cùng loài, để thu lấy chất dinh dưỡng bên trong, giúp chúng sống sót chờ đến khi môi trường thuận lợi hơn. Ngoài ra, để tránh những ảnh hưởng của môi trường khắc nghiệt, chúng thường tạo ra bào tử, nhưng cách này tiêu hao khá nhiều năng lượng.

2.2. Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước 0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8µm.

Bacillus sp. dưới kính hiển vi điện tử (nguồn: internet)

Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 100^oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong 200 – 300 năm.

3. Đặc điểm sinh hóa

Lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose và arabinose. Thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein, (+), citrate (+), có khả năng di động (+) và hiếu khí (+).

3.1. Đặc điểm nuôi cấy

Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát triển được trong môi trường thiếu oxy. Nhiệt độ tối ưu là 37^oC, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4.

Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ bản:

• Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.
• Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều.
• Trên môi trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 4cm sau 72 giờ nuôi cấy.

Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi lượng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như glucose) và nitơ (như peptone).

Nuôi cấy Bacillus subtilis (nguồn: internet)

3.2. Bộ gen của Bacillus subtilis

Năm 1997, người ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của Bacillus subtilis và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn này. Bộ gen chứa 4,2 mega-base, xấp xỉ 4.110 gen. Trong số đó, chỉ có 192 gen không thể thiếu được, 79 gen được dự đoán là thiết yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào.

3.3. Bào tử và khả năng tạo bào tử

3.3.1. Bào tử

Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới.

Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 – 0,9 µm x 1,0 – 1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein, peptidoglycan… Bào tử của chúng có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày, tiến đến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non. Đây là đặc điểm quan trọng trong ứng dụng sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis (Nguyễn Duy Khánh, 2006).

3.3.2. Khả năng tạo bào tử

Nhờ khả năng tạo bào tử mà vi khuẩn có thể tồn tại được trong các điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, môi trường tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại và nhiệt độ cao…).

Quá trình hình thành bào tử gồm các bước sau:

• Hình thành những búi chất nhiễm sắc;
• Tạo tiền bào tử;
• Tiền bào tử hình thành hai lớp mảng, tăng cao tính bức xạ;
• Tổng hợp các lớp vỏ bào tử;
• Giải phóng bào tử.;
• Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử sẽ nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng mới (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003).

Các giai đoạn chính của quá trình bào tử hoá ở Bacillus subtilis (nguồn: Wiki)

4. Bacillus subtilis – Sức mạnh của trực khuẩn trong nuôi trồng thủy sản

Giống Bacillus phân bố rất rộng trong tự nhiên, nhất là trong đất, chúng tham gia tích cực vào sự phân hủy vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào. Do sự đa dạng sinh thái và loài nên các hoạt chất sinh học của chúng cũng rất phong phú. Triển vọng ứng dụng Bacillus trong nhiều lĩnh vực đời sống, đặc biệt là trong nuôi trồng thủy sản là rất to lớn.

Một số loài thuộc nhóm vi khuẩn Bacillus như: B. subtilis, B. aterrimus. B. niger, B. pumilis, B. panis, B. vulgarus, B. nigrificans, B. natto, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. megaterium, B. mesentericus… đã được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản với vai trò cải thiện sức khỏe, tăng cường các phản ứng miễn dịch và cải thiện môi trường.

Một trong những đặc tính nổi trội của nhóm vi khuẩn này là khả năng sinh các enzyme phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh (Vibrio) giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng.

4.1. Cơ chế tác động của Bacillus subtilis

Cạnh tranh dinh dưỡng, ức chế sự sinh trưởng vi khuẩn gây bệnh và nấm: bổ sung Bacillus subtilis giúp làm tăng số lượng lợi khuẩn trong ruột, làm cạnh tranh dinh dưỡng và nơi sống với vi khuẩn gây hại. Mặt khác, chúng còn sản sinh một số loại kháng sinh làm ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn gây bệnh và các loại nấm giúp trung hòa độc tố hoặc tiêu diệt mầm bệnh.

Tổng hợp các chất kháng sinh: Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp một số chất kháng sinh làm ức chế sinh trưởng, tiêu diệt các vi sinh vật khác, tác dụng lên nấm gây bệnh và vi khuẩn Gram (-), Gram(+). Các loại kháng sinh này có cấu trúc và phổ hoạt động kháng khuẩn khác nhau. Do đó, Bacillus subtilis có khả năng chống lại các mầm bệnh khác nhau.

Tổng hợp enzyme: Bacillus subtilis tồn tại ở trạng thái bào tử, khi vào dạ dày nó không bị acid cũng như các men tiêu hóa ở dịch vị phá hủy, nên nó có thể nảy mầm trong ruột non và sinh sôi trong đường ruột. Ở ruột, bào tử nảy mầm và phát triển thành thể hoạt động giúp cân bằng hệ vi sinh có ích trong đường ruột, cải thiện hệ thống tiêu hóa. Giai đoạn này, Bacillus subtilis tổng hợp nhiều chất có hoạt tính sinh học có lợi cho cơ thể như các enzyme thủy phân (protease, α-amylase) và một số enzyme.

Một số ứng dụng cơ bản của Bacillus subtilis (nguồn: dinhduongsaigon.com)

4.2. Ứng dụng Bacillus sp. trong nuôi trồng thủy sản

Các ứng dụng của Bacillus subtilis chủ yếu dựa trên 3 cơ chế tác động như trên, cụ thể như sau:

4.2.1. Cải thiện sức khỏe vật nuôi

4.2.1.1. Đóng góp nguồn dinh dưỡng và enzyme tiêu hóa

Cung cấp dinh dưỡng trực tiếp

Một số nghiên cứu trên các đối tượng nuôi thủy sản như: luân trùng, Artemia, nhuyễn thể, ấu trùng giáp xác, cá… cho thấy Bacillus sp. đã trực tiếp cung cấp chất dinh dưỡng cho vật nuôi đặc biệt là acid béo và vitamin.

Một nghiên cứu khác trên cá hồi chấm hồng Bắc cực (Salvelinus alpinus L) kết quả cũng cho thấy vi khuẩn có thể đã có vai trò quan trọng trong quá trình dinh dưỡng của cá. Nghiên cứu tương tự trên tôm thẻ trưởng thành (Penaeus chinensis) cho thấy hệ vi sinh vật đã cung cấp nguồn dinh dưỡng và là nguồn thức ăn trực tiếp cho tôm.

Vì vậy, ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. trong nuôi trồng thủy sản thường cho kết quả cao về tỉ lệ sống, tăng trưởng và hiệu quả kinh tế.

Hỗ trợ tiêu hóa

Vài loài vi khuẩn đã được nghiên cứu trên động vật hai mãnh vỏ cho thấy vi khuẩn còn góp phần hỗ trợ tiêu hóa do chúng sản sinh các enzyme như proteases, lipases, giúp cho quá trình tiêu hóa của vật chủ tốt hơn.

4.2.1.2. Tăng cường các phản ứng miễn dịch

Vi khuẩn có thể làm tăng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu. Một nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trộn vào thức ăn trên cá hồi nước ngọt (Rainbow trout), kết quả làm tăng sự đề kháng với vi khuẩn gây bệnh Vibrio thông qua làm tăng hoạt động thực bào của bạch cầu.

Một nghiên cứu khác của Rengpipat et al., (2000) trên đối tượng tôm sú cũng cho rằng sử dụng Bacillus sp. (S11) giúp vật nuôi ít nhiễm bệnh do vi khuẩn Bacillus sp. đã tiết ra các chất làm tăng đáp ứng cả miễn dịch tế bào lẫn miễn dịch dịch thể. Balcázar (2003) chứng minh Bacillus sp. làm tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm thẻ do khống chế V. harveyi và virus đốm trắng.

Một nghiên cứu khác của Hadi Zokaei et al., (2009) trộn Bacillus sp. vào thức ăn tôm thẻ chân trắng làm tôm tăng trưởng nhanh và tỉ lệ sống cao hơn so với đối chứng, mặt khác mật độ Bacillus sp. cũng tăng nhanh trong hệ tiêu hóa của tôm và mật độ Vibrio giảm.

4.2.2. Cải thiện môi trường

4.2.2.1. Phân hủy các chất thải

Bacillus sp. tiết ra enzyme phân hủy các chất như carbonhydrate, chất béo và đạm thành những đơn vị nhỏ hơn. Chúng cũng có khả năng phân hủy các chất hữu cơ tích lũy trong nền đáy ao nuôi tôm.

Bacillus sp. có tác dụng làm giảm COD, H₂S trong ao tôm làm tăng năng suất nuôi. Do nhóm vi khuẩn Bacillus sp. là vi khuẩn vi khuẩn gram (+) thường phân hủy vật chất hữu cơ thành CO₂ tốt hơn nhóm gram (-).

Urê và axit uric có trong thành phần chất thải của động vật nuôi thủy sản. Quá trình amôn hóa urê trải qua 2 giai đoạn:

• Giai đoạn 1: Urê sẽ bị thủy phân tạo thành muối carbonate amôn.
• Giai đoạn 2: carbonate amôn chuyển hóa thành NH₃, CO₂ và H₂O.

Axit uric bị các vi sinh vật phân giải thành urê và acid tactronic. Sau đó urê sẽ tiếp tục bị phân giải thành NH₃. Bacillus sp. tham gia trong quá trình amôn hóa protein là quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ chứa nitơ, giải phóng NH₃.

Ban đầu protein bị phân cắt thành pepton, polypeptid oligopeptid, dipeptid và acid amin. Một phần axit amin sẽ được tế bào Bacillus sp. hấp thu làm chất dinh dưỡng, phần khác sẽ thông qua quá trình khử amin tạo thành NH₃ và nhiều sản phẩm trung gian khác tùy theo điều kiện.

Sản phẩm cuối cùng chủ yếu của quá trình vô cơ hóa hiếu khí protein là ammonia, carbonic, các muối của acid sulfuric và acid phosphoric.

4.2.2.2. Giảm chất độc NH₃, H₂S

Trong điều kiện kỵ khí, các acid amin không được vô cơ hóa hoàn toàn, bên cạnh NH₃ và CO₂ còn tích lũy nhiều loại hợp chất hữu cơ khác như acid hữu cơ, rượu, H₂S và những dẫn suất của nó như mecaptan, các chất độc như diamin và tomain, indon và scaton.

Đây là lý do người nuôi luôn phải duy trì hàm lượng oxy hòa tan cao, nhất là oxy ở đáy ao luôn cao để đảm bảo quá trình phân hủy hữu cơ xảy ra hoàn toàn. Ứng dụng Bacillus sp. trong trường hợp này làm tăng quá trình phân hủy hữu cơ, làm giảm các chất dư thừa tích tụ đáy ao, giảm phát sinh khí độc, mùi hôi đáy ao.

4.2.3. Ức chế tác nhân gây bệnh

4.2.3.1. Tiết ra kháng sinh

Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh vi khuẩn có thể tiết vào môi trường chất có tính sát khuẩn hoặc kìm hãm khuẩn gây ảnh hưởng đến quần thể vi sinh khác. Mục đích gián tiếp là cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng có sẵn trong môi trường.

Nghiên cứu của Stein (2005) cho thấy tiềm năng sản sinh chất kháng sinh của Bacillus sp. đã được ghi nhận hơn 50 năm qua. Hiện nay tác giả đã tổng kết có vài trăm dòng vi khuẩn Bacillus sp. có khả năng tiết ra hơn 20 chất kháng sinh với cấu trúc khác nhau.

Bao gồm: subtilin, ericin, mersacidin, sublancin, subtilosin, surfactin, iturin, bacillibactin, bacillmycin, mycosubtilin, fengycin, plipastatin, corynebactin, bacilysin, difficidin, oxydifficicin, bacilysocin, rhizocticin, amicoumacin, mysobaccillin…

Hầu hết các chất được tiết ra trong ruột, trên bề mặt cơ thể vật chủ hay ra môi trường nước làm rào cản sự nhân lên của vi khuẩn cơ hội gây ức chế các vi sinh vật gây bệnh. Các chất diệt khuẩn này có thể có tác dụng đơn lẽ hoặc kết hợp nhau.

4.2.3.2. Cạnh tranh dinh dưỡng

Sự cạnh tranh chủ yếu xảy ra ở nhóm vi sinh vật dị dưỡng, cạnh tranh cơ chất hữu cơ, là nguồn carbon và năng lượng. Những nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực này chưa nhiều.

Rico-Mora (1998), đã đưa một dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường nghèo hữu cơ. Cấy vi khuẩn này vào bể nuôi tảo khuê cùng với Vibrio alginolyticus, kết quả Vibrio không phát triển. Điều này chứng tỏ vi khuẩn được chọn lọc cạnh tranh lấn át Vibrio trong điều kiện nghèo hữu cơ.

Verschuere et al., (1999) đã chọn lọc vài dòng vi khuẩn có ảnh hưởng tốt đến tỉ lệ sống và tăng trưởng của ấu trùng Artemia để làm thí nghiệm. Những vi khuẩn này được đưa vào môi trường nuôi Artemia sau khi nước nuôi đã được lọc sạch.

Kết quả cho thấy chất kìm hãm được tiết ra môi trường có tác dụng chống lại vi khuẩn gây bệnh V. proteolytics CW8T2. Vì vậy, những dòng vi khuẩn chọn lọc sẽ có ưu thế trong việc cạnh tranh năng lượng và chất dinh dưỡng.

4.2.3.3. Cạnh tranh chất sắt

Tất cả các vi sinh vật đều cần chất sắt cho sinh trưởng (Reid et al., 1993). Hiện tượng siderophores là hiện tượng vi khuẩn tiết ra chất kết tủa các ion sắt có trọng lượng phân tử thấp trong môi trường. Các vi sinh vật này sẽ hấp thu các phân tử Fe kết tủa này và làm mất Fe trong môi trường.

Các vi sinh vật gây bệnh cần nhiều sắt để tăng trưởng, do vậy dẫn đến hiện tượng cạnh tranh Fe của vi sinh vật trong thủy vực, kết quả làm hạn chế mầm bệnh trong môi trường (Neilands, 1981; Wooldridge et al., 1993).

Tóm lại, các chế phẩm vi sinh có chứa vi khuẩn (trực khuẩn) Bacillus sp. có thể góp phần làm giảm rủi ro do dịch bệnh nhờ vào khả năng giúp cải thiện sức khỏe của tôm cá, cải thiện môi trường và ức chế tác nhân gây bệnh trong ao nuôi.